病毒灭活试验
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除垢剂/杀菌灭藻剂/预膜剂/缓蚀阻垢剂/粘泥剥离剂/密闭式缓蚀剂/聚丙烯酰胺/聚合氯化铝等
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1 适用范围
主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技
术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
2 试验器材
（1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。
（2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。
（3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。
（4）恒温水浴箱。
（5）二氧化碳培养箱。
（6）层流超净工作台。
（7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。
（8）液氮罐。
（9）倒置显微镜。
（10）离心机。
（11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。
（12）细胞维持培养基：见附录A。
（13）细胞完全培养基：见附录A。
（14）去离子水。
3 病毒悬液的制备
（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。
（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。
4 病毒灭活滴度计算方法
（1）终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。
TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例
（“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。
具体计算方法如下：
1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。
各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。
2）距离比例可按下式计算：
3）计算举例
设试验数据如表 2-2
表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果
|
样本 |
接种 |
细胞病变 |
累积值 |
病变比 |
病变率（%） |
||
|
稀释度 |
孔数 |
- |
+ |
细胞病变(-) |
细胞病变(+) |
||
|
10-4 |
4 |
0 |
4 |
0 |
12 |
12/12 |
100 |
|
10-5 |
4 |
0 |
4 |
0 |
8 |
8/8 |
100 |
|
10-6 |
4 |
1 |
3 |
1 |
4 |
4/5 |
80 |
|
10-7 |
4 |
3 |
1 |
4 |
1 |
1/5 |
20 |
|
10-8 |
4 |
4 |
0 |
8 |
0 |
0/8 |
0 |
本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。
（2）噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。
每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数
（3）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = log No－log Nx
5 残留消毒剂化学中和法的鉴定试验
（1）目 的
本鉴定试验只在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。
（2）试验设计原则
1） 通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。
2） 根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。
3） 中和试验用药物浓度应为正式消毒试验最高浓度。作用时间最短不得少于30s。
（3）试验分组
在使用细胞感染法进行病毒灭活试验时，对所用中和剂的鉴定，应进行以下各组试验。其中，先进行预备试验中的第 1组～3 组试验，如中和剂与中和产物对细胞生长无影响，再进行以下的正式试验。
预备试验:
1）中和剂 + 细胞 → 培养
观察所用中和剂对细胞的生长有无影响。
2）（消毒剂 + 中和剂）+ 细胞 → 培养
观察中和产物溶液对细胞生长有无影响。
3）（消毒剂 + 细胞）→培养
观察消毒剂对细胞生长有无影响。
正式试验:
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察所试消毒剂对病毒有无抑制或灭活作用。
2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 中和剂 → 接种细胞培养
观察残留消毒剂被去除后，病毒是否可恢复对细胞的感染作用。
3）中和剂 + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察中和剂对病毒有无抑制作用。
4）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 → 接种细胞培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。
5）病毒悬液 → 接种细胞培养
观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。
6）未接种病毒的细胞 → 培养
观察其生长是否正常。
（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量有关器材，依次摆放，进行编号。各组分别用适宜大小容量的无菌定量吸管按以下程序吸取或添加试剂和试验样本。各组每吸一次试剂或样本，即应更换一次吸管或微量移液器吸头，以防相互污染。
1）预备试验第 1 组。 将试验用细胞，分别加入不同稀释度的中和剂溶液，作用3 h～4h 后，吸去液体，另加细胞维持培养液，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
2）预备试验第 2 组。将试验用细胞， 分别加入不同稀释度中和产物溶液作用3h～4h 后，吸去中和产物溶液，另加细胞基础培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
3）预备试验第 3 组。将试验用细胞，分别加入不同稀释度的消毒剂，作用 3h～4h后，吸去消毒剂，另加细胞维持培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
4）正式试验第 1 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验预定的灭活病毒时间，加入1.0ml去离子水，根据试验规定量，吸取该最终样液 （或以对病毒无害的稀释液作系列稀释），进行随后的病毒滴度测定。
5）正式试验第 2 组。吸取双倍浓度消毒剂溶液 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加 0.5ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，加入 1.0ml 中和剂溶液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。
6）正式试验第 3 组。吸取 0.5 ml 去离子水于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。待作用10 min，加入 1.0 ml 中和剂溶液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
7）正式试验第 4 组。吸取双倍浓度消毒剂 0.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，加入 1.0ml 中和剂，再吸加 0.5ml病毒悬液，混匀，作用 10min。进行随后的病毒滴度测定。
8）正式试验第 5 组。吸取去离子水 1.5 ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后，再吸加 0.5 ml 病毒悬液，混匀。进行随后的病毒滴度测定。
9）正式试验第 6 组。将试验用细胞，加细胞维持培养液后，置37℃ 二氧化碳培养箱中培养。
10）本试验中对各种病毒的接种和检测操作技术，若无特殊要求，按病毒学中各种病毒的常规培养和检测方法进行即可。
（5）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
1）正式试验中第 1 组无试验病毒，或仅有少量试验病毒生长。
2）正式试验中第 2 组有较第 1 组显著为多，但较第 3、4、5（组）显著为少的试验病毒生长。
3）正式试验中第 3、4、5（组）病毒生长与原接种量相近。
4）正式试验中第 6 组细胞生长正常。
5）预备试验结果显示，中和剂和中和产物，在正式试验的最高浓度下对细胞生长无影响。
6）连续 3 次试验取得合格评价。
（6）注意事项
病毒载体中和试验法可参照上述悬液定量中和试验程序，并按照病毒学原理进行适当修改后使用。
6 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验
病毒灭活试验中的物理除药法，首先稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。
（1）分 组
1）消毒剂 + 病毒悬液 → 接种培养
观察所试消毒剂对病毒有无灭活或抑制作用，对细胞正常生长有无影响。
2）（消毒剂 + 病毒悬液） + 除药处理 → 接种培养
观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。
3）病毒悬液 + 除药处理 → 接种培养
观察除药处理对病毒滴度有无影响。
4）病毒悬液 → 接种培养
观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。
5）未接种病毒的细胞 → 培养
观察细胞生长是否正常。
（2）悬液定量操作程序
1）第 1 组。吸取消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间，根据试验规定量，吸取该最终样液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
2）第 2 组。吸消毒剂 0.9ml 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.1ml 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
3）第 3 组。吸取病毒悬液 0.1ml，加 0.9ml细胞基础培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
4）第 4 组。 吸取病毒悬液 0.1 ml， 加细胞维持液 0.9ml，不加消毒剂亦不做任何除药处理。根据试验规定量，吸取该病毒悬液（或用适宜的对病毒无害的稀释液作系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。
5）第 5 组。 向未接种病毒的细胞管内，加入完全细胞培养基培养。
（3）评价规定
试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格:
1）第 1 组无试验病毒，或仅有少量生长。
2）第 2 组有远较第 1 组为多，但明显较 3组～5组为少的试验病毒生长。
3）第 3、4、5 （组）试验病毒生长量相近。
4）连续 3 次试验取得合格评价。
5）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。
7 脊髓灰质炎病毒灭活试验
（1）目的
测定消毒剂对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）灭活所需的剂量，以验证病毒污染物消毒实用剂量。
（2）实验原理
用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或实验组与对照组）样本中脊髓灰质炎的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对脊髓灰质炎的灭活率。
（3）试验分组
1）试验组。根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设定适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于30s。
2）阳性对照组。用去离子水代替消毒剂，按试验组规定步骤加入脊髓灰质炎悬液进行试验和培养，观察脊髓灰质炎生长是否良好。
3）阴性对照组。用不含脊髓灰质炎的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。
（4）脊髓灰质炎悬液定量灭活试验操作程序
1）从液氮中取出冻存的试验宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，并用细胞维持液洗涤两次后，转种于加有10ml完全培养基培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
2）取出低温冻存的脊髓灰质炎-1毒株，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。收获时，将培养液取出，用超声波或反复冻融破碎宿主细胞，尽快离心，并将含病毒的上清液按每管1.0ml分装于无菌离心管（1.5ml）中，冷冻保存于-80℃备用。
3）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中备用。
4）取100μl有机干扰物质与100μl病毒原液混合，于20℃±1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待检消毒剂，立即混匀并记时。作用规定时间，立即取出0.1ml，加入中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。
5）阳性（病毒）对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。
6）各组分别进行病毒滴度测定，可采用终点稀释法或噬斑法进行。
7）试验重复3次。
8）终点稀释法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后在96孔培养板上滴定各稀释度样本中残留的病毒量，每个稀释度做4孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞），在37℃，放置1h～2h，以确保残留病毒全部吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持培养液。继续放入二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）培养，逐日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d，逐孔观察并记录细胞病变情况。
终点稀释法病毒感染滴度的计算：以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。
9）噬斑法操作步骤：先用细胞维持培养液对待滴定样本做10倍系列稀释，然后接种于细胞培养瓶中，滴定各稀释度样本中残留的病毒量。
接种细胞前，将生长致密的单层细胞中的培养液倾出，加入1ml待测样品，放置37℃吸符1h～2h，倾出样液，加入含0.8%琼脂的细胞维持液3ml，冷却后翻转细胞瓶，放置37℃培养48h～72h。然后每瓶细胞加入2ml甲醛溶液固定数分钟，用自来水冲洗后加结晶紫溶液染色数分钟，冲洗干净后计数。细胞瓶内圆形不着色的透明区即为一个蚀斑单位，每毫升测试样品中的病毒含量计算：
pfu/ml＝平板平均蚀斑数×稀释倍数
注意：为了便于计数，病毒蚀斑数一般控制在每细胞瓶10pfu～30pfu。
（5）平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值 = log No－log Nx
（6）评价规定
1）脊灰病毒灭活试验，可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤用化学消毒剂对病毒的灭活效果。病毒的灭活滴度，应达到4个对数值。
2）在正常情况下，3次试验的平均灭活对数值≥4.00，可判为对脊髓灰质炎病毒污染物消毒的实验室试验合格。同时，阳性对照组病毒滴度对数值应在5～7 之间。
（7）注意事项
1）操作人员应具有基本的病毒学实验工作经验，尽量使用移液器与无菌一次性吸头。
2）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。
3）如使用病毒载体进行试验，可参照上述悬液定量试验程序，并遵照病毒学原理进行适当修改后使用。
