杀灭分枝杆菌试验

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除垢剂/杀菌灭藻剂/预膜剂/缓蚀阻垢剂/粘泥剥离剂/密闭式缓蚀剂/聚丙烯酰胺/聚合氯化铝等

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1 目的 

在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上分枝杆菌所需剂量，以验证对分枝杆菌（包括结核杆菌）实用消毒剂量。

2 试验器材

(1) 试验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326。

(2) 培养基 分枝杆菌干燥培养基(上海奥普生物医药有限公司)。

(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备。

(4) 中和剂 (根据 2.1.1.5 所示方法鉴定合格者)。

(5) 稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液。

(6) 消毒剂稀释用硬水：见附录A。

(7) 有机干扰物质：见附录A。

(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

(9) 恒温水浴箱。

(10) 喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。

(11) 电力混合器。

(12) 计时装置。                                                                          

(13) 恒温培养箱。

3 龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326 菌悬液的制备

（1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml～10.0mlMADC肉汤或罗氏肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，于 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，于 37℃ 培养 72h，即为第3代培养物。密封后，在4℃保存，时间不得超过6周。

（2）试验时取第3代斜面培养物，在分枝杆菌琼脂斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5代～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至一含有6-7g玻璃珠的无菌圆锥底试管中，在电动混合器混合至少5min。然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。

（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。

（4）菌悬液保存在4℃ 冰箱内备用。当天使用不得过夜。

4 试验分组

    试验分为下列各组:

    (1) 试验组，按 2.1.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。

    (2) 阳性对照组， 以硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。

    (3) 阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。

5 试验程序

常用杀灭试验有: 悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验、载体喷雾定量杀菌试验等。其操作程序详见 2.1.1.7.4，2.1.1.7.5，2.1.1.7.6。接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，在37℃中培养1周，观察最终结果。

6 评价规定

(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均 ≥4.00 ，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均≥3.00，可判定该产品对分枝杆菌污染物消毒合格。

(2)产品鉴定检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，可判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品使用说明书规定的使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，可判为试验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。