物理法去除残留消毒剂试验

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1.目 的

通过本鉴定试验，确定常用的物理去除法是否可去除消毒体系中残留的消毒剂，使消毒剂鉴定试验显示出真正的杀菌效果。

2.试验器材

（1）过滤冲洗法需用经过灭菌处理的滤器、微孔滤膜、真空泵（或抽滤泵）。

（2）离心沉淀法需用离心机与离心管。

（3）吸附柱、分子筛柱（主要供病毒灭活试验用）。

（4）无菌稀释液、冲洗液。要求不应影响除药材料（如滤膜、吸附柱等）的性质，对微生物无伤害作用。常用的有：水、缓冲液（如PBS）、稀释液、含0.1%～0.5%吐温80的PBS、中和剂（可中和部分消毒成分）。

（5）其他器材随所用试验微生物而定。

3.试验设计原则

（1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用，对试验用微生物以及其恢复期培养是否有害或不良影响。

（2）试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。浓度过低不足以显示能否将高浓度消毒剂全部去除。

（3）鉴定试验中，消毒后去除残留消毒剂组无微生物生长，不能表明去除处理后细菌是否复苏。此时可增加处理时间或次数，亦可适当缩短作用时间再试。作用时间最短不得少于30s，否则难以控制试验的准确性。

（4）同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，所用物理去除消毒剂法应按微生物种类分别进行鉴定试验，不得互相取代。对细菌繁殖体的试验，可在大肠杆菌（8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）或金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）中任选其一进行试验即可；对细菌芽孢，以枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢进行。

当用其他特定微生物 （如龟分枝杆菌脓肿亚种） 进行杀灭试验时，均应以该特定微生物再次进行去除消毒剂方法的鉴定试验。

（5）鉴定中应根据正式杀灭试验的设计，选择使用悬液定量试验，还是载体定量试验。通常，悬液鉴定试验结果可用于载体试验。

4.物理去除方法的鉴定

（1）分组方法如下：

1）消毒剂 + 菌悬液 → 培养

观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制作用。

2）（菌悬液 + 消毒剂） + 过滤冲洗法处理 → 培养

观察所用去除消毒剂处理后，受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。

3）（菌悬液 + 水） ＋过滤冲洗法处理 → 培养

观察去除消毒剂处理是否影响试验菌的生长数量。

4）菌悬液 → 培养

作为菌悬液阳性对照值。

（2）操作程序如下：

1） 第 1 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂（应先置 20℃±1℃中水浴）于试管内，混匀，作用至试验预定时间。吸取该最终样液0.5ml，加于含4.5ml 稀释液试管中，混匀。吸取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数。

2） 第 2 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml消毒剂于试管中，混匀。作用至试验预定时间，对其进行去除消毒剂处理，并取最终样液 1.0ml 接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。如平皿生长菌落数均超过300 个，应再吸取该最终样液 0.5ml，用 PBS 做适当稀释，选择适宜稀释度悬液，吸取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数。

3） 第 3 组。吸取0.5ml试验菌悬液于试管内，加入0.5ml有机干扰物质，混匀后，置20℃±1℃ 水浴中 5min 后，再吸加4.0ml硬水于试管内，混匀。不加消毒剂，做同上处理。取最终样液 0.5 ml 用稀释液做 10 倍系列稀释，选择 2个～3个适宜稀释度悬液，各取 1.0ml，分别接种于平皿内，做活菌培养计数（如为滤膜法，可先进行10 倍系列稀释，再经过滤冲洗法处理，然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面）。

4） 第 4 组。吸取试验菌悬液 1.0ml，置含 4.0 ml 稀释液的试管中，不加消毒剂，亦不作任何去除处理，进行活菌培养计数，作为阳性对照值。

（3） 评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数生长。

2） 第 2 组有远较第 1 组为多，但较第 3、4（组）为少的试验菌生长。在第 1 组无菌生长时，第 2 组平均每个平板 （或滤膜） 上生长菌落不少于 5 个。

3） 第 3、4 （组）测定的结果，微生物数量应在 1×10⁷ cfu/ml～5×10⁷ cfu/ml 之间，其组间差不得超过两组回收菌数平均值的50%。组间差的计算可按下式进行:

4）连续 3 次试验取得合格评价。

5）本规范推荐使用过滤冲洗法。