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细菌芽孢悬液的制备

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主营:
除垢剂/杀菌灭藻剂/预膜剂/缓蚀阻垢剂/粘泥剥离剂/密闭式缓蚀剂/聚丙烯酰胺/聚合氯化铝等

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1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含5 ml10ml营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置37℃培 18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,于37℃培养 18h24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,于37℃培养 18h24h,即为第 3 代培养物。

2)用10.0ml 吸管吸取5.0 ml10.0ml 3代~5代的18h24h 营养肉汤培养物,接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面,再将多余肉汤培养物吸出,将罗氏瓶置于37℃温箱内,培养 5d7d

3)用接种环取菌样少许涂于玻片上,固定后以改良芽孢染色法染色,并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时,即可进行以下处理。否则,应继续在室温下放置一定时间,直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

改良芽孢染色法:①用接种环取菌样涂布于玻片上,待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好,放54℃~56 条件下,加热 30min。取出,去滤纸,用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。0.5% 沙黄水溶液,染1min。水洗,待干后镜检。芽孢呈绿色,菌体呈红色。

4)罗氏瓶培养物,用10.0ml 吸管加10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中,以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液,再向瓶内吸加5.0ml 无菌蒸馏水,重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中,振摇5min,打碎菌块,使成均匀的芽孢悬液。

5)必要时,将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中 24h,使菌自溶断链,分散成单个芽孢。

6)用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液,清除其中的琼脂凝块。

7)将过滤后的芽孢悬液,置无菌离心管内,以3000 r/min 速度离心 30min。弃上清液,加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗,先后共3遍。

8)将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中,并加入适量小玻璃珠。

9)将芽孢液放于80水浴中 10min(或6030min),以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,保存于4冰箱中备用。有效使用期为半年。

10)芽孢悬液在使用时,应先进行活菌培养计数。

11)怀疑有杂菌污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

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